荧光定量PCR引物设计 

qPCR引物设计需遵循一定的方法和原则，如研究的目的基因已经有文献报导，可以使用文章材料和方法中给出的引物进行后续qPCR实验；如没有报导，须先确定目的基因的mRNA序列，有参物种可以直接到GenBank数据库中查到准确的mRNA序列，无参物种须先通过高通量测序测出部分mRNA序列或进一步通过RACE实验得到全长mRNA序列后再设计引物。

mRNA序列确定后就可以通过软件来设计引物，推荐使用Primer3、Primer5、MFold等软件进行设计，通过软件可以帮助我们分析引物的基本质量，如引物序列中是否存在错配，二聚体，发卡结构等，通过软件设计的引物最终也要进行Blast比对，确保设计的引物在该物种中只能检测目的基因，保证其特异性。

SYBR染料法引物设计需遵循以下原则：引物长度18～30 bp、产物长度100～400 bp、G/C含量40～60%、避免引物内含有互补序列 (尤其是3’端)、避免3’ 端错配、3’端不能出现连续三个以上的G或C、避免3’端出现T碱基 、设计跨内含子引物。

TaqMan探针及引物需遵循以下原则：TaqMan探针退火温度比引物高10℃、没有连续相同的碱基、探针位置尽可能靠近上游引物、C远远多于G、5’ 端没有G；TaqMan探针法引物设计原则除了包含SYBR染料法所有原则外，需注意5’ 端不要有G，因为G会淬灭发光基团发出的荧光。

荧光定量PCR实验设计 

qPCR实验设计要确定对照，对照设置包括两个方面，其中一个方面为阴性对照，重要的阴性对照包括NTC（No template control）和NRC（No reverse transcriptase control），前者检验是否有模板污染，具体操作是以水为模板，观察扩增情况；后者检验cDNA中是否有基因组DNA污染，具体操作是在反转录的时候多配制一个体系，不加反转录酶，其余成分正常添加，经历相同的反转录过程，以此为模板，观察扩增情况。建议以cDNA为模板时，两个阴性对照同时检测下，排除模板及基因组DNA污染对定量的影响，如果以基因组DNA为模板，只需进行NTC检测；

另外一个方面为阳性对照，包括：带有PCR扩增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸、重组质粒DNA、体外反转录的RNA、来自于特定的生物体样本的RNA或DNA及国际上公认的生物学标准物等。阳性对照可以帮助我们快速判断失败的扩增是否是试剂失效或仪器故障导致。

qPCR实验设计要选择合适的定量方法，研究基因表达差异最常用的是相对定量，它有两个重要的方法：△△Ct法和双标准曲线法。前者特点包括：只依靠Ct值、用于大通量（很多基因，如芯片结果）、计算简单、估计性的结果、要求目的基因和内参基因扩增效率都比较好。后者其实是先做了绝对定量再进行比较，其特点包括：结果精确、对扩增效率要求不高、构建目的基因与内参基因的标准品、相当于两个绝对定量、每次反应都要作标准曲线。

下面我们通过两个具体的实验案例来深入了解两种定量方法的计算过程。

荧光定量PCR案例分析之△△Ct法 

第一个实验案例是运用△△Ct法进行表达量分析，作者比较病毒刺激细胞后，细胞抗病毒基因ISG54的表达情况差异。实验样品包括病毒刺激细胞以及对照细胞。使用的试剂包括RNA提取，反转录及SYBR染料法qPCR Mix。

因为是相对定量，涉及比较，因此要选择内参基因进行校正，作者在此案例中选择了GAPDH作为内参基因，设计内参和目的基因引物，完成两个基因在实验组和对照组模板中的qPCR检测，统计各基因在两个模板中的Ct值（参见图一）。

图一

利用2^-△△Ct法公式进行定量计算，这个公式包括两个△Ct，整个计算过程为：先进行第一个△Ct的计算，也就是均一化计算，在每一组模板中使用目的基因的Ct值减去内参基因Ct值，△Ct_对照=26.84-18.20=8.64，△Ct_实验=23.64-18.22=5.42；

再进行第二个△Ct的计算，这一步是比较计算的过程，将每组模板均一化的Ct值与对照组中均一化的Ct值进行相减，此案例中作者选择对照组细胞作为参照，所得值代入公式，△Ct_实验-△Ct_对照=5.42-8.64=-3.22，2^-（-3.22）=9.32，计算得出的值即为最终的表达量值，表明ISG54基因在病毒刺激的细胞中表达量提高了9.32倍；

在介绍双标准曲线法之前，还要补充一点，做绝对定量原始标准品拷贝数如何计算，以一个腺病毒质粒标准品为例，首先计算质粒标准品的平均分子量MW，MW=总碱基数×2×330，然后计算拷贝质量，拷贝质量=平均分子量MW/阿伏伽德罗常数，最后将质粒浓度/拷贝质量得出质粒标准品的拷贝数。原始质粒标准品拷贝数得到后，每个梯度稀释的标准品的拷贝数都是已知量，将梯度稀释的标准品质粒进行qPCR检测，得到不同的Ct值，此时就可以计算出Ct值与拷贝数对数之间的线性关系方程，即标准曲线方程Y=-a×LogX+b，将标准曲线的斜率带入到方程式E=10^(-1/slope)-1就可以计算出引物的扩增效率（参见图二）。

图二

荧光定量PCR案例分析之双标准曲线法

第二个实验案例是关于双标准曲线法计算基因的相对表达量，作者利用TaqMan探针法研究ERBB2在正常或乳腺肿瘤组织标本中的表达差异，选择GAPDH作为内参基因，利用FAM标记ERBB2探针，用VIC标记GAPDH探针，构建了GAPDH和ERBB2标准品质粒，分别将两个标准品质粒进行梯度稀释，将梯度稀释的标准品质粒和待测样品同时进行qPCR检测，得到标准曲线，同时统计内参和目的基因在两个待测样品中的Ct值（参见图三）。

图三

第一步计算将内参基因的Ct值代入到内参的标曲中，将目的基因ERBB2的Ct值代入到目的基因的标曲中，全部转换为拷贝数，第二步计算为在每组模板中，目的基因拷贝数除以内参基因拷贝数，完成均一化计算，第三步计算为选择参照物进行比较，作者选择正常组织模板作为参照，将乳腺肿瘤组织中均一化的拷贝数除以正常组织中均一化的拷贝数，得到最终的表达量值1.63，表明ERBB2在乳腺肿瘤组织中表达量相对于正常组织提高了1.63倍（参见图四）。

图四

荧光定量PCR参照染料ROX的选择 

qPCR实验设计最后补充一点独立的内容，参照染料ROX的选择，首先，我们要明确它的作用包含以下几点：

1. 调整非PCR因素造成的误差，如加样误差；

2. 提供较稳定的基线；

3. 部分仪器在使用前会使用标准化荧光信号进行校正。

可以看出，ROX使用与否只跟仪器相关，如果qPCR仪能够自动校正孔间荧光信号差，就不需要添加ROX，否则需要使用ROX进行校正。一般情况下，ABI和安捷伦的仪器需要加ROX，BioRad、Roche、Corbett仪器不需要添加。