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RNA纯化常见问题解答

发布时间:2020-06-18 21:20:15点击量:388

Q:提取过程中 RNA 降解

A:

• 材料中的 RNA 发生降解:尽量选择新鲜的材料,材料采集后应迅速用液氮处理。材料

保存在液氮中或 -70℃条件下,材料均不宜长期保存,且避免反复冻融。幼嫩新鲜的材料 RNA 含量高且完整,衰老或病害等受损的材料中 RNA 降解比较严重。

• 操作环境的 RNase 污染:RNA 提取尽量选择洁净的环境,由于自然条件下空气中含有较多的 RNase,建议对提取环境进行 RNase 的清除处理。

• 提取用具带来的 RNase污染:提取用所有的玻璃器皿可通过高温灭活 (160℃烘烤 4-5 小时)去除 RNase。RNA 材料所接触的所有塑料制品 (如枪头、电泳槽、移液器等)都需要通过 DEPC 或 NaOH 处理严格去除 RNase 后才可使用。

• 操作中带入的 RNase 污染:人的皮肤、汗液和呼出的气体中含有大量的 RNase。操作人

员可通过经常更换一次性手套,佩戴口罩等措施减少此类污染。


Q:RNA 提取量低

A:

• 材料 RNA 含量较低:对于 RNA 含量较低的纤维组织 (肌肉组织或纤维素较高的植

物组织) 可适当提高起始材料的用量。

• 材料中蛋白和脂肪含量较高:蛋白和脂肪含量较高的材料可用氯仿对上清再次抽提。

• RNA 沉淀条件不合适:使用异丙醇沉淀 RNA 时,加入的异丙醇与提取液的比例为严

格的 1:1,否则会明显影响 RNA 沉淀的效率和 RNA 的纯度。特殊材料 (如含有多糖、多酚等) 可通过添加适量的柠檬酸钠来改善沉淀效果。


Q:RNA 中有基因组 DNA 污染

A:

• 材料中核酸含量高:脾脏、胸腺等组织中的核酸含量较高,可进行多次酚 / 氯仿抽

提以去除多余的 DNA。也可以在提取后加入 DNase I 处理,降解 DNA。

• 材料过量:增加试剂用量。

• RNA 沉淀条件不合适:使用异丙醇沉淀 RNA 时,加入的异丙醇与提取液的比例偏高,

溶液的 pH 值偏小,都容易使 DNA 形成沉淀。


Q:提取后的 RNA 样品降解

A:

• RNA 样品反复冻融:反复冻融会使 RNA 片段断裂,影响 RNA 的完整性。

• RNA 样品保存条件不合适:根据保存时间和材料的不同,RNA 应保存在不同的溶液中。

如从胰脏、肝脏等 RNase 含量较高的材料中提取的样品需要储存在甲醛或甲酰胺中以保存高质量的 RNA,而在脾脏中提取的 RNA 可在水中长期稳定保存。